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東邦大学理学部
生物分子科学科
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研究紹介

 

研究の目的

複雑で高度に秩序化された生体内反応を制御するために,生体はさまざまな情報をやり取りしています。これらはいくつかの細胞内情報伝達系で制御されていますが、より深く理解するためには、情報伝達に関与する分子が、いつ、どこで、どのように働くかを明らかにすることが必要です。しかし従来の方法論だけでは、この素過程を生理的条件に近い時間および空間分解能で再現して解析することは困難でした。蛍光プローブによるリアルタイム可視化解析の進展は,このような解析を可能にする強力な方法論を提供しつつあります。このような状況下で,情報伝達に関与する分子同士の相互作用を,できるだけ生理的環境に近い条件で再現する手法の重要性はますます高まりつつあります。そこで、ケージド化合物の化学を活用して、細胞内あるいは細胞間での情報のやり取りを,高い時間および空間分解能で操作する手法の開発を目的として研究を行っています。

ケージド化合物とは?

ケージド化合物とは、光分解性の保護基で生理活性分子を保護し,一時的にその活性を失わせた分子のことです(図)。光を照射することで,瞬時に元の生理活性分子を出現させることが出来ます。シグナル分子が機能発現する時期と場所を,光を照射する時期と場所で制御することが可能になり,照射光量 で発現する量を調節することも原理的には可能となるため,シグナル伝達に関与する分子の時空間動態を,リアルタイムで制御する強力な方法になります。
ケージド化合物
ケージド化合物の合成に利用できる光分解性保護基としては,2-ニトロベンジル基が知られていて,すでにいくつかのセカンドメッセンジャー,神経伝達物質,およびペプチド等のケージド化合物合成に利用されています。しかし,光反応の効率が低い,ケージ解除の反応速度が遅い,ケージ解除後の副生成物に毒性がある等の問題点も指摘されています。また,ケージド化合物として現在手に入れることができる分子の種類は非常に限られているため,誰でも簡単に自分の系に適用するまでには至っていないのが現状です。そこで,私たちのグループでは,これまでに報告されているケージド化合物の問題点を解決するべく研究を進め,新しい光分解性保護基(ケージ)をいくつか開発してきました。中でも、Bhc基(6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-ylmethyl基)は,従来のものに比べて様々な点で優れていることが明らかとなってきました。ケージとしてのBhc基は、・紫外光によるケージ解除の効率が高い,・暗所での安定性が高い,・2光子励起を利用することで近赤外光によるケージ解除が可能である,・簡単な修飾を施すことで様々な方法で細胞内に導入することができる,などの特徴をもちます。

シグナル伝達を光で制御する

セカンドメッセンジャーのケージド化合物として、cAMP、cGMP、ジアシルグリセロールおよびアラキドン酸のケージド化合物の合成にも成功した。それぞれの構造を図に示した。合成法の最適化、光反応性の検討および酵素反応の光制御能等を明らかにし、さらに、cAMPに関しては、様々な細胞内への導入法に対応できるように、膜透過性のものと水溶性が高いものを合成した。膜透過性誘導体はメダカの色素胞へ導入し、cAMPが関わるシグナル伝達系を光照射によって繰り返し制御できることを確認した。また、水溶性誘導体をパッチピペットによって単離嗅細胞に導入し、匂い感知後のシグナル伝達を光照射によって再現することも可能であった。もちろん、ただ再現するだけではない。Bhc-ケージドセカンドメッセンジャーを活用することで、シグナル伝達のカスケードを止めて、光照射によって、任意の場所で任意のタイミングでスタートさせることができるのである。
シグナル伝達を光で制御する

神経伝達を擬似的に再現する

ケージド神経伝達物質を脳スライスサンプルに適用して、電気生理学的手法と組み合わせることで、神経細胞間の情報伝達を光照射によって擬似的に再現して解析することが可能となる。代表的な神経伝達物質はアミノ酸である。アミノ酸をケージド化合物にするには2つの方法がある。光分解性のエステルとしてカルボン酸部位を保護するか、光分解性のカルバメートとしてアミノ基部位を保護するかである。Bhc基のアミノ酸のケージとしてのscope & limitationを明らかにするために、神経伝達物質である各種アミノ酸のBhcカルバメート(Bhcmoc-AA)とBhcエステル(AA-OBhc)を合成した。ケージド化合物の性質を評価する基準の1つとして、光照射によるケージ解除反応の効率がある。ケージ解除の効率は、モル吸光係数(ε)と光反応の量子収率(φ)の積、φεで表すことができる。照射した光をどのぐらいの効率で吸収して、さらにそれをどのぐらいの効率でケージ解除に利用できるかを定量的に表した値である。もちろん、大きければ大きいほど効率が高いことになる。いずれのBhc-ケージドアミノ酸とも、UV光照射によってほぼ定量的にアミノ酸を放出し、しかも1光子励起の光感受性の面でも申し分ない性質を持っていることが分かった。例えば、典型的な2-ニトロベンジル型のケージド化合物のFeは20-100程度であるのに対して、Bhc-ケージドアミノ酸のφεは300-900であった。実際、マウス脳のスライス上においても、Bhc-Gluを使うと従来の2ーニトロベンジル型Gluの1/5程度の光量で十分であることが分かった。さらに、2光子励起と併用することで、神経細胞間の情報伝達を擬似的に再現することにも成功した。
神経伝達を擬似的に再現する

遺伝子の機能を光で制御する

生体における情報のやりとりの主役分子はタンパク質である。細胞内において、時期および部位 特異的に、任意のタンパク質の濃度を制御することができれば、細胞内シグナル伝達の機構の理解は飛躍的に深まるであろう。そこで、Bhcケージド化合物の応用の1つとして、遺伝子の発現を時期および部位 特異的に活性化することを検討した。サイクリックヌクレオチドのケージド化合物合成用に開発したBhc-ジアゾを用いることで、mRNAのケージド化合物(Bhc-mRNA)を合成することができた。Bhc-mRNAをゼブラフィッシュ初期胚に導入することで、任意のmRNAの時期および部位 特異的な発現をin vivoで行うことにも成功した(図)。同様な考え方でタンパク質レベルでの機能発現の光制御も可能となる。さらに、ケージド化合物の化学を拡張することで、任意の遺伝子およびタンパク質の機能阻害を行うことも可能になるであろう。もちろん、これまでの小分子のケージド化合物の化学を活かすこともできる。例えば、ステロイドホルモン等、核内のレセプターと結合することで転写 を活性化する分子をケージド化合物にすれば、任意の遺伝子の発現を転写レベルで光制御できるはずだ。これに関連して、我々は、コール酸類のケージド化合物の合成にも成功している。コール酸類は、核内にあるFXRのリガンドで、自らの生成を制御する遺伝子発現を調節していることが分かってきた。これをさらに発展させて、任意の遺伝子の発現を転写レベルで調節する技術へ応用するべく研究を進めている。
遺伝子の機能を光で制御する

タンパク質の機能を光制御する

遺伝子産物としてのタンパク質の機能を,それらが本来あるべき時期に,あるべき場所(細胞または組織)で解析するための新手法を提供することを目的として研究しています。その新手法とは,ケージド化合物の化学を活用して,タンパク質の機能発現と機能阻害を時期および部位 特異的なものにすることです。既に,私たちのグループで新たに開発したケージド化合物(PNAS, 1999, 96, 1193-2000)を活用して,mRNAの機能発現を,時期および部位特異的にすることに成功しています(Nature Genetics, 2001, 28, 317-325)。この方法を,mRNAの機能阻害に適用することも現在進行中です。これらのバックグラウンドを活かしつつ,タンパク質レベルでの機能発現と機能阻害を,生きている細胞内で実現することを目指しています。細胞内で起こっていることをリアルタイムで可視化解析する技術は,爆発的な勢いで進展しています。この研究で目指しているリアルタイムの機能制御と合わせて用いることによって,空間と時間が関わる全ての生物現象において,これまでの方法では解析できなかったことが解析できて,見えなかったことが見えてくるはずです。

2光子励起の効率を評価する

2光子励起によってケージ解除ができれば、ケージド化合物の空間分解能をさらに活かすことができる(Denk, W. et al. 1990)。2光子励起とは、高密度レーザー光照射による非線形な2光子吸収過程を利用したもので、紫外部に吸収を持つクロモフォアをその約2倍の波長である赤外光照射によって励起する方法である。極微少な領域のみが励起されるので,深さ方向にも高い空間分解能を得ることができる。2光子励起法には次のような利点がある。1)励起領域自体が小さいので,光退色(photo bleaching)が抑えられる,2)同様の理由で,一重項酸素発生等による細胞の光損傷(photo damage)の危険性も減る,3)組織等による励起光の散乱がより小さいので深部まで励起光が届く。フルオレセインやGFPなど、代表的な蛍光性分子に関しては、2光子励起の基礎的データもほぼ揃っており、2光子励起蛍光イメージングは、実用の域に達していると言ってよい。これに対して、ケージド化合物に関しては、その有用性が繰り返し指摘されているにもかかわらず、わずか数例が報告されているのみで、2光子励起の利点を活かすような研究環境はまだ整っていない。その主な理由は、2光子励起に適したケージド化合物がなかったからである。極超短パルス赤外レーザーとLD励起固体レーザーを組み合わせることで、Bhc-ケージド化合物を効率良く2光子励起し、ケージ解除反応させる事に成功した。さらに、この効率を定量的に評価し、比較検討するためのシステムを構築した。