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第22回 生化学セミナー

 

隅山 健太 先生のご講演

2019年7月19日(金)に第22回生化学セミナーが開催され、理化学研究所 生命機能科学研究センター高速ゲノム変異マウス作製支援ユニット ユニットリーダーの隅山 健太 先生が「交配不要の次世代遺伝学:トリプルCRISPR法による第一世代両アリル完全KOマウス作製」の演題でご講演されました。
第22回 生化学セミナー
日時:2019年7月19日(金) 17:00 – 18:30
場所:東邦大学医学部1号館8階 東邦会館第1, 2会議室

隅山 健太 先生
国立研究開発法人理化学研究所 生命機能科学研究センター
高速ゲノム変異マウス作製支援ユニット ユニットリーダー

交配不要の次世代遺伝学:トリプルCRISPR法による第一世代両アリル完全KOマウス作製

【講演要旨】 近年のCRISPR/Cas9法の登場によりゲノムを効率よく編集できるようになり、受精卵への直接インジェクション法によりノックアウト動物が効率よく作製できるようになったが、通常作製した最初の世代の動物の両アリルのノックアウト率は100%ではなく、複数の遺伝子の同時ノックアウトではさらにその効率が低下してしまう問題があった。このため両アリルノックアウトの動物の表現型解析にはさらに交配操作が必要になり、多大な時間と労力を割かねばならなかった。そこで私たちは第一世代マウスでの表現型解析を実現するため、CRISPR/Cas9法の改良を試みた。まず、ターゲット効率が良くオフターゲットが少ないガイドRNAのデザイン法を開発し、マウス各遺伝子の有効な標的配列のデータベースを整備した。さらに、ひとつの遺伝子に対して3ヶ所のガイドRNA標的部位を設定することで、単一gRNAよりも飛躍的に効率を上げることに成功し、1世代目で安定してほぼ100%の高い確率で両アリルノックアウトマウスを作成することに成功した。さらにこの方法でダブルノックアウト、トリプルノックアウトの作製も可能であることを示した。本トリプルCRISPR法の開発により、遺伝子改変マウスをこれまでにはない効率規模で作製できるようになり、高スループットの表現型解析法と組み合わせることで、時間、労力、動物使用数の大幅な削減を実現しながら大規模な遺伝子スクリーニングを行うことが可能となった。
 また、他の次世代遺伝学技術である、Tol2 DNA トランスポゾンシステムを利用した高効率トランスジェネシス法、および100%ES細胞由来の第一世代マウスを容易に作成できるマイクロデバイスについても紹介する。

References
1. Sunagawa, Sumiyama, and others. "Mammalian reverse genetics without crossing reveals Nr3a as a short-sleeper gene." Cell Reports (2016) 14: 1–16
2. Niwa and others. "Muscarinic Acetylcholine Receptors Chrm1 and Chrm3 Are Essential for REM Sleep" Cell Reports (2018) 24: 2231-2247
3. Sumiyama, Kawakami, Yagita. "A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection."Genomics (2010) 95, 306-311
4. Sumiyama and others. "Easy and efficient production of completely embryonic-stem-cell-derived mice using a micro-aggregation device." PLOS ONE (2018) 13(9): e0203056

世話人:中野 裕康(生化学)(内線2355)